学 分：2
实验学时：32
一、课程性质与教学目标
《鱼类遗传与育种学实验》是水产养殖专业的一门应用性及实践性很强的专业必修课，要求学生通过本课程的学习，系统掌握鱼类选择育种、杂交育种、倍性育种、良种繁育和品种推广等育种学的基本技能和基本方法，并能应用所学专业知识分析和解决生产中的育种问题。课程以提高学生专业综合能力为教学理念，增加与生产应用直接相关的专业系统性创新创业实践教学大板块，强化学生专业实践操作技能培训和考核。着力培养学生综合运用专业知识解决品种选育、良种繁育等生产应用问题的能力，并着力提高学生的创新创业能力。
一、基本要求
该课程要求学生系统全面地掌握鱼类养殖生产的各项技术，并能根据各种养殖鱼类的生物学特点和养殖水体条件，选择合理的养殖模式，提高各类养殖水域的生产力和经济效益。同时要求学生熟练掌握与鱼类人工繁殖有关的亲鱼培育、人工催产、人工授精、鱼苗孵化、杂交育鱼、多倍体育种及品种选育等技术，鱼类苗种培育技术，食用鱼养殖技术，活鱼运输、越冬技术，以及现代水产养殖的先进模式和技术。
三、主要教学方法
本课程主要通过讲授、讨论、练习、演示及操作等多种方法相结合，通过典型案例的学习和相关实验实训，培养学生的创新意识和创新思维能力，使学生能够明确了解品种选育和良种繁育的内涵，学习创新方法、开拓创新思路，提高创新设计能力。
四、实验教学内容
项目一 鱼类肾细胞的染色体制备
【实验类型】综合性
【实验学时】 4学时
【实验目的】
1.了解利用鱼类头肾细胞制备染色体标本的原理和技术。
2.掌握鱼类头肾细胞制备染色体标本的具体步骤和方法。
【实验内容摘要】
1.实验鱼的预期处理
2.实验鱼取材
3.低渗处理
4.固定处理
5.制备染色体玻片
6.染色体观察
【实验基本要求】
1.实验鱼的预期处理
按10ug/g鱼体重向鱼体腹腔注射PHA溶液，6h后再向鱼体腹腔注射与第一次相同剂量PHA溶液，在25℃水箱中饲养12 h后按5ug/g鱼体重注射秋水仙素溶液，在25℃水族箱中饲养2.5h。
2.实验鱼取材
预期处理后将实验鱼断头放血5min，放血后取鱼肾脏于0.8%的生理盐水中洗涤去结缔组织后放于2ml离心管内用眼科手术剪尽量将组织块剪碎。剪碎后用长嘴吸管吹打数次使细胞分散，吹打时力度不可过大以免将细胞悬液溢出。吹打结束后静置5min使组织块沉淀，吸取细胞悬液于另一干净离心管中，1000r/s离心15min。
3.低渗处理
弃上清液，加入适量0.5%KCl / 0.075mol/L KCl溶液(预热37℃的低渗液)，用手轻轻击打离心管底部，利用回旋力将细胞打散，力度要轻以免细胞破裂。击打均匀后将其放入37℃烘箱中低渗处理120 min，期间，反复吹打多次。低渗结束后，1000r/s离心20min。
4.固定处理
弃上清液，收集细胞加少许新配置的卡诺固定液，将细胞击打散后再加入适量卡诺固定液，固定30min，固定结束后1000r/s离心15min。重复固定三次。
5.制片染色体玻片
弃上清液，加入新配制的卡诺固定液8滴，将细胞击打均匀。冰冻玻片倾斜45°放置，在距离玻片高50cm左右滴片，每片滴2-3滴，不能重叠滴加，空气自然干燥。干燥后将磷酸缓冲液（pH=7.3）与Giemsa母液按9:1混合制成染液（现配现用），每片玻片滴加数滴染液，染色30min。染色后用自来水冲洗（冲洗玻片背面），自然干燥后观察。
6、染色体观察
在油镜下选取来自同一地区不同个体的50—100个分散良好，形态清晰，数目完整的中期分裂相，用0ptimas软件系统手工统计每个分裂相的染色体数目，并进行显微摄影。找出染色体数目的众数，即为该地区鲫鱼染色体的倍性。
【主要仪器设备名称及规格、型号】
莱卡光学显微镜、研钵、电子天平、4个1000mL容量瓶、2支10mL离心管、量筒、小烧杯、培养皿、培养箱、加热棒、镊子、眼科手术剪刀、1mL注射器、冰冻离心机、1.5mL离心管、CCD照相仪、长嘴吸管、香柏油、二甲苯、载玻片2盒、载玻片盒5个。
项目二 鱼类肾细胞的染色体核型分析
【实验类型】验证型
【实验学时】 2学时
【实验目的】
1.学习染色体组型分析的方法；
2.掌握显微摄影及图像处理技术。
【实验内容摘要】
1.确定染色体数目
2.将每条染色体进行随机编号；
3.测量每一条染色体的长臂、短臂长度；算出染色体的全长和臂比值。
4.配对：根据所测数据结合目测，按次缢痕的有无和位置、染色体长度是否相等将同源染色体配对。
5.计算同源染色体中两条染色体长、短臂及总长的平均值，并把这些数值换算成相对长度；
6.排队：将同源染色体对按一定原则排队，并编号。
7.用Adobe Photoshop进行核型分析
(1) 染色体随机编号 (2) 测量
(3) 配对 (4) 剪裁
(5) 染色体编号 (6) 排列
【实验基本要求】
1.染色体随机编号：打开Photoshop软件，鼠标左键点击文件按钮→打开→选择要打开的染色体图片→鼠标左键点击左侧横排文字工具（T）→选择横排文字工具对染色体进行编号。
2.测量：鼠标左键点击视图→选择标尺→选择单位（mm）→鼠标左键点击分析（A）按钮→选择标尺工具测量长臂、短臂。实际长度换算如下：
染色体臂长的实际长度=测量长度×比例尺实际长度/比例尺测量长度
如：该染色体臂长的测量长度为59.65 mm，比例尺（10um）测量长度为149mm，则染色体臂长的实际长度=（59.65mm×10um）/149mm=0.65um
3.配对：根据目测和染色体相对长度、臂比、着丝粒位置及次缢痕的有无及位置，随体的有无、形状及大小等特性将同源染色体配对。
4.剪裁：将同源染色体配对后根据中部、亚种部、压端部及端部着丝点等类型，按着由大到小的原则使用套索工具对染色体进行剪裁，可选择多边形套索。
【主要仪器设备名称及规格、型号】
惠普电脑一台，Photoshop CS 4软件、镊子、剪子、计算器。
项目三 鱼类的远缘杂交与育种
【实验类型】设计型
【实验学时】 6学时
【实验目的】
1.掌握杂交育种的原理及杂交育种的方法；
2.掌握杂交种的鉴定方法及杂交育种的步骤；
3.了解杂交育种的应用，远缘杂交及特点。
【实验内容摘要】
1. 亲鱼品种选择：红白虎头和红白蝶尾雌雄个体各选取30尾，均选取45～50g之间的白色占1/2左右的个体。
2. 亲鱼购买与配组：挑选形态特征明显，成熟度好的健康亲鱼，放入水泥繁殖池中 (5m×3m×0.3m)。
3. 亲鱼繁殖（人工授精）与胚胎发育：将追逐的金鱼打捞起来进行一对一人工湿法受精，受精完成后放入对应的鱼缸自然孵化，每个鱼缸只放入一对鱼的受精卵，每个组合3个重复。
4. 鱼苗饲养与管理：平游鱼苗陆续出现后，开始投喂蛋黄水，一周后投喂活的鱼虫至40日龄。后开始投喂蛋白含量为40 %的饲料，每15天观察一次鱼苗的颜色变化
5. 体色类型划分与数据处理：开始时的鱼苗体色都为青灰色，随生长过程，鱼苗的颜色会逐步出现分离。统计分离的颜色类型，用方差分析数据，讨论结果。
【实验基本要求】
1. 鱼类杂交育种方案的具体步骤。
2. 杂交亲本选择，杂交种的鉴定和观察。
【主要仪器设备名称及规格、型号】
一次性注射器（1mL），毛巾，孵化鱼缸。
项目4 鱼类三倍体的诱导及鉴定
【实验类型】设计型
【实验学时】 6学时
【实验目的】
1.了解人工诱导鱼类三倍体的原理、方法
2.了解多倍体技术在水产动物育种上的意义
3.初步掌握鱼类三倍体的温度休克诱导方法。
【实验内容摘要】
1.锦鲤亲鱼鉴定
2.锦鲤亲鱼人工催产
3.人工授精及孵化
4.三倍体诱导
5.数据统计
【实验基本要求】
1.锦鲤亲鱼鉴定：繁殖季节，雄鱼鳃盖、胸鳍上有白色颗粒状追星，体表粗糙，挤压腹部有精液流出。雌鱼泄殖孔较突出、红肿，挤压腹部有卵粒流出。
2.人工催产：采用腹腔注射法，用LHRH-A2+HCG+DOM混合注射。注射催产剂后10-15小时，检查雌鱼，轻压腹部，如有卵粒呈线状流出，比例达到70%以上，即可进行人工授精。
3.受精及孵化：依次挤出亲鱼卵子和精子，立即用羽毛搅拌，待充分受精后，撒在网片上，放入孵化缸内进行流水孵化。
4.三倍体诱导：人工受精后10分钟，用3℃处理受精卵25分钟。也可事先督促学生查阅相关文献，分组自行设计实验方案，
5. 数据统计
待发育到原肠期时统计受精率，受精率=受精卵数/总卵数×100%。2天后把孵化的仔鱼用移液管移到另一个培养皿中，同时用计数器计数。孵化率=孵化数/受精总卵数×100%。
【主要仪器设备名称及规格、型号】
1台数码恒温水浴锅、玻璃培养皿、保鲜袋、移液器、显微镜、载玻片、一次性注射器（1 mL）、计时器、不锈钢带孔漏筛（5个）、毛巾
项目5 鱼类四倍体的诱导及鉴定
【实验类型】设计型
【实验学时】 6学时
【实验目的】
1.了解人工诱导鱼类四倍体的原理、方法
2.了解四倍体技术在水产动物育种上的意义
3.初步掌握鱼类四倍体的温度休克诱导方法。
【实验内容摘要】
1. 白乌鳢亲鱼鉴定
雄鱼身体狭长，腹部扁平；雌鱼身体宽阔，腹部饱满。在繁殖季节，雄鱼鳃盖、胸鳍上有白色颗粒状追星，体表粗糙，挤压腹部有精液流出。雌鱼泄殖孔较突出、红肿，挤压腹部有卵粒流出。雌雄比例为白乌鳢雄鱼少，雌鱼比例略高些。
2. 人工催产
采用胸鳍皮下注射法，用LHRH-A2+HCG+DOM混合注射，注射量为雌鲫每尾0.1ml，雄鲫剂量减半。注射催产剂后10-15小时，检查雌鲫，轻压腹部，如有卵粒呈线状流出，比例达到70%以上，即可进行人工授精。因雄鲫精巢发育同步性差，往往很难挤出足量的精液，因此须杀雄取精。
3. 受精及孵化
人工授精前，准备准备好授精所需的器具（如剪刀、抹布、碾钵等）。先把授精用的工具清洗干净，放在阴凉处凉干。授精操作在室内进行，以免阳光杀伤卵子和精子。将成熟度良好的二、四倍体雌鱼的卵挤入培养皿中。杀死雄鲫，取出精巢，擦净血迹后，细细，并用林格氏液稀释，一尾雄白乌鳢的精巢可加入50毫克林格氏液。随后按如下方式进行受精：2n♀×2n♂立即用羽毛搅拌，待充分受精后，撒在网片上，放入孵化缸内进行流水孵化。
4. 四倍体诱导
（1）热休克处理适宜温度的筛选
根据白乌鳢人工诱导三倍体以及预实验得出的数据，确定设置本次实验的处理适宜温度为40℃±0.5℃，进行最佳的处理起始时间和处理持续时间的探究。
（2）热休克处理起始时间和处理持续时间受精后5min，倾去培养皿中的水，将其迅速置于0～3℃的冰水中，严格控制温度。处理30min后取出。置于曝气的水中室温孵化。
5. 数据统计
孵化过程中经常更换曝气的水，保持室内空气新鲜和流通。另外，及时用吸管吸出死亡的胚胎并计数。待发育到原肠期时统计受精率，受精率=受精卵数/总卵数×100%。2d后把孵化的仔鱼用移液管移到另一个培养皿中，同时用计数器计数。孵化率=孵化数/受精总卵数×100%。
【实验基本要求】
1）人工诱导鱼类四倍体的原理
2）鱼类四倍体的温度休克诱导原理和步骤,
3）温度休克诱导实验方案的设计
4）四倍体鱼类的性腺发育；
5）四倍体鱼类的经济价值；
6）人工诱导四倍体鱼类的方法；
7）鉴定四倍体鱼类的方法；
【主要仪器设备名称及规格、型号】
3台数码恒温水浴锅、玻璃培养皿、保鲜袋、移液器、显微镜、载玻片、一次性注射器（1 mL）、计时器、不锈钢带孔漏筛（5个）、毛巾
项目6 鱼类雌核发育的人工诱导
【实验类型】设计型
【实验学时】 8学时
【实验目的】
1.了解人工诱导鱼类雌核发育的原理、方法
2.了解雌核发育技术在水产动物育种上的意义
3.初步掌握鱼类雌核发育的温度休克诱导方法。
【实验内容摘要】
1．精卵的收集
达到效应期后，挤出精液并镜检，将活力良好的精液放于4℃冰箱中待用。匙吻鲟亲鱼用LHRH-A2直接进行人工催产，催产剂量为6μg/kg（分2次注射，间隔12h），到达效应时间(12～24h)后，人工挤卵并均分成若干等份待用。用细胞计数板和生物计数皿在显微镜下分别计算出精、卵密度为3.50×109~4.20×109 个/mL和50~60个/mL。
2． 精子的遗传失活及热休克参数的筛选
根据热休克起始时间、持续时间和休克温度三因子三水平设计正交实验(表II6-3) 。由步骤1.3.1得出的最佳精子照射时间作为本次实验精子紫外照射时间进行照射，然后与10mL卵在孵化碗中进行授精，并分别在授精16min、18min、20min后将受精卵迅速置于35℃、37℃、39℃恒温水浴锅中的孵化网中进行热休克，轻轻摆动以使受精卵受热均匀，热休克2min后，取出受精卵并置于18℃水温中进行孵化。设立正常白乌鳢精液、鳜鱼精液分别与白乌鳢卵授精、不进行热休克的分别作为实验对照组，另取最佳照射时间处理的鳜鱼精子与卵子授精、不进行热休克的一组为精子质量控制组。
3．异源精子诱导极体雌核发育
为了证明筛选出来的诱导参数是最适宜的诱导参数，依据这些参数进行如下试验：试验分为5个处理，第1个处理为同源授精组（D1），用新鲜白乌鳢精子授精，然后进行孵化作为对照；第2个处理为杂交组（D2），用未失活鳜鱼精子与白乌鳢卵直接授精，以检测其杂交潜力；第3个处理为失活组（S），鳜鱼精子用863μW/cm2剂量的UV照射5min使其遗传失活，然后进行人工授精；第4个处理为杂交休克组（Gy2），用未失活精子授精，于受精后的18min，采用热休克处理 2min；第5个处理为失活休克组（Gy1），用同样失活处理的精子授精，其他同第四处理。受精卵在麦氏孵化器中孵化，并于受精后的25hpf（25 hour after fertilization， 原肠中期）、 47hpf(晚神经胚期)、138hdpf(孵化出膜期)和210hpf（孵化后存活3d）分别计算存活率。
失活组（S）的胚胎是单倍体，孵化时呈现显著的畸形，出现一系列单倍体综合征:头（眼）小，体躯较短，围心腔扩大、水肿、尾椎弯曲、色素减少、血液循环不全、畸形等 。因此，要获得具有生存能力的雌核发育个体，就要使卵子的染色体加倍。
4． 数据统计
每组实验进行2～3次重复。孵化期间，每隔3h停气，清除死卵并分别统计实验组及对照组的受精率、孵化率、雌核发育率(雌核发育二倍体苗占受精卵的百分比)及幼鱼成活率（体长达10cm以上幼鱼的存活尾数占孵出鱼苗数的百分比）。再用t检验法比较各组数值差异，当P<0 .05时，认为有显著差异。
计算受精率、存活率、孵化率和正常率，计算公式为
受精率=原肠中期存活卵数/受精卵数×100%
孵化率=初孵仔鱼数/受精卵数×100%
初孵仔鱼正常率=正常初孵仔鱼数/总初孵仔鱼数×100%
5.雌核发育后代的鉴定
本实验采用初孵雌核发育仔鱼形态学测量、染色体分析、流式细胞仪检测细胞中DNA相对含量来鉴定各实验组初孵仔鱼是否为雌核发育单倍体、雌核发育二倍体。以期探讨该群体的倍性水平，为今后进行鱼类异质雌核发育多代诱导、纯系的建立等遗传育种的研究提供重要的遗传学依据。
(1)形态学测量
经MS-222(150mg/L)麻醉鱼体后，观察体形、体色，用电子天平称量体重，用电子数显游标卡尺(精确度为0.1mm)测量可量性状，测量方法参照Bonar 等(1988)提出的淡水鱼类形态特征测量标准，并计数每条鱼的可数性状(主要是鳍条数目)。
先用Excel计算各性状比值，包括体长/头长、体长/吻长、体长/背前区长、体长/体高、体长/体宽、体长/尾柄长、体长/尾柄高、体长/眼间隔、头长/体高、头长/吻长、尾柄长/尾柄高等。然后，利用SPSS13.0软件进行数据统计和分析。对普通白乌鳢与雌核发育白乌鳢的各相应参数进行检验(t-test)，检测差异的显著性水平(P<0 .05，表示有显著性差异，P<0 .01表示有极显著性差异)。
2染色体制备
以人工诱导的白乌鳢二倍体鱼苗和对照组白乌鳢鱼苗为对象，待鱼苗长至20~30cm时，各实验组随机取10尾，剪尾鳍进行尾鳍细胞的培养，培养方法参照Freshney（2000）的方法。将传至第2代的尾鳍细胞继续培养24h后更换新鲜培养基，添加终浓度为1μg/mL的秋水仙素处理，培养13～15h。吸出培养液，胰酶-EDTA消化分散细胞，离心收集细胞，参照Wang等（2004）的方法进行染色体制片，高倍显微镜下观察计数尾鳍细胞的染色体数目，并采用Photoshop CS4和Excel统计各个实验组的染色体分布频率。
【实验基本要求】
（1）人工诱导鱼类雌核发育的原理
（2）鱼类雌核发育的温度休克诱导原理和步骤
（3）温度休克诱导实验方案的设计
（4）雌核发育鱼类的性腺发育；
（5）雌核发育鱼类的经济价值；
（6）人工诱导雌核发育鱼类的方法；
（7）鉴定雌核发育鱼类的方法；
【主要仪器设备名称及规格、型号】
9cm的亲水性塑料培养皿，紫外线杀菌灯（日本东芝公司），水平摇床，紫外线照射装置暗箱、精密恒温水浴锅。
【实验药品】
HGC 、LRH -A2、
五、考核方式
考核类型：考查
考核形式：闭卷
六、主要参考资料
1. 《水产动物遗传育种学实验指导》，李雅娟编著，中国农业科学技术出版社，2012年7月。
2. 《鱼类遗传与育种学实验实训指导教程》，邹远超编著，科学出版社，2017年10月。
3. 《淡水鱼类远缘杂交实验报告》，金万昆编著，中国农业科学技术出版社，2009年1月。
4. 《鱼类分子育种学》，孙效文编著，海洋出版社，2015年5月。
5. 《水产动物育种学》，范兆廷编著，中国农业出版社，2005年10月。
6.《水产生物繁育技术》，罗建仁,白俊杰编著，化学工业出版社，2011年2月1日。
